邻苯二甲酸二丁酯对雌性大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.011

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (42): 6779-6783.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.42.011

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邻苯二甲酸二丁酯对雌性大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响

王雪金¹，周云清¹，罗湘闽¹，刘瑾²

1福建医科大学附属第二医院妇产科，福建省泉州市 362000
2福建医科大学公共卫生学院预防医学系，福建省福州市 350108

修回日期:2014-09-10 出版日期:2014-10-08 发布日期:2014-10-08
通讯作者: 周云清，主任医师，福建医科大学附属第二医院妇产科，福建省泉州市 362000
作者简介:王雪金，女，1983年生，福建省石狮市人，汉族，福建医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事妇科内分泌研究。
基金资助:
福建省泉州市科技计划项目(2011Z96)；福建省卫生厅青年科研课题(2012-2-52)

Dibutyl phthalate influences the secretion of rat ovarian granulose cells

Wang Xue-jin¹, Zhou Yun-qing¹, Luo Xiang-min¹, Liu Jin²

1Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
2Public Health Institute of Fujian Medical University, Fuzhou 350108, Fujian Province, China

Revised:2014-09-10 Online:2014-10-08 Published:2014-10-08
Contact: Zhou Yun-qing, Chief physician, Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
About author:Wang Xue-jin, Master, Attending physician, Department of Obstetrics and Gynecology, Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Quanzhou 362000, Fujian Province, China
Supported by:
the Science and Technology Plan of Quanzhou City, No. 2011Z96; the Youth Scientific Research Project of Fujian Health Bureau, No. 2012-2-52

摘要/Abstract

摘要：

背景：已有研究表明邻苯二甲酸二丁酯对雄性动物生殖系统具有一定的毒性作用。
目的：进一步验证邻苯二甲酸二丁酯对大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响。
方法：体外培养25日龄未成熟雌性SD大鼠卵巢颗粒细胞，分别加入邻苯二甲酸二丁酯使终浓度分别为(0，5，20，80 μmol/L)，培养24 h。采用放射免疫方法测定雌二醇和孕酮的水平；采用实时荧光定量PCR测定大鼠颗粒细胞中细胞色素芳香化酶(P450arom)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA的水平。
结果与结论：邻苯二甲酸二丁酯染毒后颗粒细胞分泌的雌二醇及孕酮水平下降，邻苯二甲酸二丁酯可降低颗粒细胞中P450arom和P450scc mRNA的表达，且表达量与邻苯二甲酸二丁酯剂量呈反比。结果提示邻苯二甲酸二丁酯可引起雌性大鼠生殖系统的功能紊乱，对其生殖系统具有毒性作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 邻苯二甲酸二丁酯, 颗粒细胞, 细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶, 细胞色素芳香化酶, 雌二醇, 孕酮

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that dibutyl phthalate has certain toxicity to the reproductive system of male animals.
OBJECTIVE: To investigate the effects of dibutyl phthalate on secretion of rat ovarian granulose cells.
METHODS: Ovarian granulosa cells from 25-day-old female Sprague-Dawley rats were cultured in vitro and exposed to different concentrations of dibutyl phthalate (0, 5, 20, 80 μmol/L) for 24 hours. Estradiol and progesterone in ovarian granulosa cells were measured by the method of radio-immunity. Expression of the cytochrome P450aromatase and P450 side chain cleavage enzyme mRNA in granulosa cells were examined by real-time PCR.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of estradiol and progesterone in granulosa cells decreased after exposure to dibutyl phthalate. With the increase of the dibutyl phthalate concentration, the expression of P450arom and P450scc mRNA decreased gradually. Dibutyl phthalate could induce reproductive dysfunction and toxicity to female rats.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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Key words: phthalic acids, cytochromes, urogenital system, estradiol, progesterone

中图分类号:

R318

王雪金，周云清，罗湘闽，刘瑾 . 邻苯二甲酸二丁酯对雌性大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(42): 6779-6783.

Wang Xue-jin, Zhou Yun-qing, Luo Xiang-min, Liu Jin . Dibutyl phthalate influences the secretion of rat ovarian granulose cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(42): 6779-6783.

图/表（结果） 1

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引言

随着人类社会的进步和工业的发展，为方便人类生活，化学合成物质大量流入人们的日常生活和环境中，但随之而来的是日益严重的环境污染。这些化学物质通过食物链或污染的环境危害着人类的健康^[1]。因此，如何在日常生活中有效利用这类化学物质，同时把环境污染减少到最低，以改善人类生活环境、提高人类健康水平是当今人们共同关注的问题。

邻苯二甲酸酯(dibutyl phthalate，DBP)是一类结构相似并广泛应用的化学物质，主要用于软化塑料和增强塑料的弹性。各种医学仪器、室内装磺材料、塑料等均离不开邻苯二甲酸酯。此类材料是添加剂而不是以化学键的形式与终产品结合，在使用过程中，将不断地释放到周围环境中，对环境造成污染^[2]。目前邻苯二甲酸酯类已经成为世界上最广泛存在的污染物之一。该类物质的毒性和安全性已经引起欧美国家的广泛关注^[3]。

邻苯二甲酸二丁酯是邻苯二甲酸酯类化合物的一种，是塑料增塑剂的主要材料，同时也用于印刷油漆、医用产品(血袋、血液透析装置等)、化妆品、杀虫剂、汽车玻璃等^[4-5]。邻苯二甲酸二丁酯广泛存在人类的工作和生活中，如以邻苯二甲酸二丁酯为原料的产品制造、邻苯二甲酸二丁酯的生产、含有邻苯二甲酸二丁酯的材料的使用，或者是通过环境中大量存在的邻苯二甲酸二丁酯，包括水、食物和空气等。研究发现，生育年龄的妇女(20-40岁)较其他年龄的妇女和男性血中邻苯二甲酸二丁酯的量高得多^[6]，可能与化妆品、指甲油、发胶的使用有关，具体原因还不清楚。研究发现，一般人群的血清、脂肪和精液中均检测到邻苯二甲酸二丁酯，生产邻苯二甲酸二丁酯的职业人群可通过皮肤和吸入接触邻苯二甲酸二丁酯，其血中浓度更高^[7-8]。

因为用作增塑剂的邻苯二甲酸酯类化合物是以氢键或范德华力与塑料分子相结合，所以在使用的过程中，它遇有机溶剂或水时极易被释放出来^[9]，经欧盟委员会认定，邻苯二甲酸酯类是一种致癌物质、其通过呼吸、皮肤和饮食接触等途径进入人与动物体内，可诱导有机体发生突变和再生有毒物质^[10-11]。已有动物实验表明邻苯二甲酸二丁酯能干扰正常生殖系统的功能，也可以导致激素依赖性器官肿瘤发病增加。其中研究较多的是对雄性生殖系统损害的研究，如可致睾酮合成量较少，精子生成障碍^[12-14]，睾丸生精上皮发育明显异常，精曲小管变薄、萎缩、间质细胞异常增生，睾丸下降不良，隐睾发生显著增高，附睾管腔中的精子数显著减少甚至缺乏。睾丸质量减轻及生殖道发育畸形等，提示它们具有明显的生殖毒性作用^[15-17]。目前邻苯二甲酸二丁酯对雌性动物的生殖毒性研究较少。

本实验通过检测大鼠离体卵巢颗粒细胞在邻苯二甲酸二丁酯染毒后培养上清液中雌二醇及孕酮水平及颗粒细胞中细胞色素芳香化酶(P450arom)、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶(P450scc)mRNA表达的变化情况，来探讨邻苯二甲酸二丁酯对卵巢分泌功能的影响及其机制。

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材料方法

设计：单一样本、分组对照、细胞学实验。

时间及地点：实验于2012年6月至2013年12月在福建医科大学基础医学院完成。

材料：

实验动物：25日龄未成熟雌性SD大鼠，由福建医科大学实验动物中心提供，清洁级，体质量(80±20) g，动物许可证号：SCXK(闽)2012-0001。

实验方法：

卵巢颗粒细胞的分离培养：每只皮下注射孕马血清促性腺激素，1 000 IU/kg，48 h后脱颈椎处死大鼠。在无菌条件下，分离双侧卵巢，去除其周围组织及表面包膜，用PBS清洗后置于预冷的DMEM培养基中。在解剖显微镜下用眼科剪剪破有腔卵泡，轻轻拍打与挤压，使卵母细胞及颗粒细胞同时逸出，反复轻轻吹打，使颗粒细胞释放入DMEM培养基中，收集、清洗、离心、吹散，制成单细胞悬液。经锥虫蓝染色显示90%以上为活细胞，调整细胞浓度至3.5×10⁸ L^-¹后将细胞接种到6孔培养板中，于培养箱(37 ℃、体积分数5%CO₂)中预培养48 h后，更换不含血清的培养基继续培养24 h后，分别加入不同浓度邻苯二甲酸二丁酯使得各组邻苯二甲酸二丁酯终浓度分别为0，5，20，80 μmol/L，继续培养24 h后收获细胞。

各组颗粒细胞中雌二醇与孕酮的测定：取各处理组中上清液，采用放射免疫法检测E2和P的含量，严格按照说明书进行操作。批内和批间变异系数分别<10%和<15%。

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测各组卵巢颗粒细胞中P450arom和P450scc mRNA表达水平：各处理组中除去上清，按Trizol试剂盒操作说明书提取颗粒细胞总RNA。紫外分光光度计分别测量波长在260 nm和280 nm处的吸光度值，A₂₆₀/A₂₈₀均>1.8；用Dnase I处理总RNA以消除基因组DNA的干扰后以RNA纯化柱回收RNA，按反转录试剂盒说明书操作合成cDNA。

采用TaKaRa公司SYBRPremixExTaq^TM试剂盒，以GADPH mRNA为内参基因，P450arom、P450scc和GAPDH引物由上海生工公司合成。

在Real time PCR仪(TAKARA Thermal Cycler Dice TP900)上进行PCR反应。采用比较阈值法测定目的基因的相对表达^[18]，目的基因的相对表达量=2^-^ΔΔCt，ΔΔCt＝(ΔCt，目的基因-ΔCt，内参基因)实验组-(ΔCt，目的基因-ΔCt，内参基因)对照组。

主要观察指标：①不同剂量邻苯二甲酸二丁酯对卵巢颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响。②Real-time PCR检测各组卵巢颗粒细胞中P450arom和P450sccmRNA的表达结果。

统计学分析：用SPSS 18.0数据分析软件进行数据统计分析。实验结果以x(_)±s表示，各组之间差别比较采用单因素方差分析，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

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讨论

目前人们生活和工作中面临的邻苯二甲酸酯暴露往往是指一个低剂量、慢性、长期甚至终生的过程，所以对健康的影响可能需要一个漫长的时间才会表现出来。而研究较多的是对邻苯二甲酸酯急性暴露所引起的生殖缺陷、致癌性^[19-20]。

邻苯二甲酸二丁酯是一类常见的邻苯二甲酸酯类化合物，具有雌激素样效应和抗雄激素作用^[21-22]，作为一种雌激素类环境干扰物，人或动物接触邻苯二甲酸酯后，通过改变雌激素水平或者模拟雌激素作用，从而干扰内分泌系统的正常功能，表现出对生殖内分泌、胚胎和发育毒性及致癌作用。有研究显示，急性暴露于大剂量邻苯二甲酸酯可以导致动物大量脱毛、摄食减少、体质量下降、后代减少或没有后代，甚至直接死亡。一项在脊椎动物的研究中发现，大剂量的邻苯二甲酸二己酯或者邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯暴露可以导致动物的直接死亡^[23]。

目前研究较多的是其对雄性动物生殖器官发育的影响，如邻苯二甲酸二丁酯可通过抑制生精细胞TERT的表达，使端粒酶活性降低从而导致生精细胞损伤，对大鼠的睾丸功能具毒性作用^[24]；可促进生精细胞的凋亡而减少精子的生产量^[25]；可抑制睾酮的合成，从而影响雄性动物生殖器官的发育^[26-28]，也可通过抑制睾丸Leydig细胞胰岛素样因子3的表达水平，导致睾丸发育不良^[29-30]，但是关于邻苯二甲酸二丁酯对雌性动物生殖毒性的报道较少。

青春期是雌性动物生殖系统发育的关键时期^[31]，对内、外源性激素的反应非常敏感，该时期性激素水平的细微波动即可对其生殖系统产生巨大影响^[32-33]。

卵巢颗粒细胞是卵巢主要的功能细胞，是卵泡内主要的体细胞成分，它介导促性腺激素对卵母细胞的调节，同时通过自分泌和旁分泌作用，维持有利于卵母细胞成熟的微环境。在卵母细胞成熟和卵泡发育的过程中发挥重要作用^[34-36]，因此，颗粒细胞的功能与卵母细胞的生长、发育、成熟密切相关。体外分离培养卵巢颗粒细胞是研究卵巢作用功能的基础；本实验成功地体外培养了大鼠卵巢颗粒细胞，为研究邻苯二甲酸二丁酯对大鼠卵巢颗粒细胞分泌功能的影响奠定了基础。

雌二醇和孕酮是由卵巢颗粒细胞和卵巢膜细胞共同作用产生的，胆固醇是它们合成的前体，主要是运载低密度脂蛋白的胆固醇。血浆中通过低密度脂蛋白与其特异的受体结合，将胆固醇转入细胞内，胞浆内的类固醇激素合成急性调节蛋白将胆固醇由线粒体外转运到线粒体内，再由线粒体内膜上的胆固醇侧链裂解酶P450scc转变为孕烯雌酮，孕烯醇酮在微粒体酶3β-羟基类固醇激素脱氢酶作用下转化为孕酮^[37-40]。孕酮通过弥散作用进入相邻的膜细胞，并在17α-羟化酶和其他酶的催化作用下形成雄烯二酮，然后进入颗粒细胞，再通过17β-羟基类固醇脱氢酶作用生成睾酮，睾酮经细胞色素P450芳香化酶(P450arom，CYP19) 又可进一步转化为雌二醇^[41-44]。P450 arom和P450Scc分别是雌二醇和孕酮合成过程中限速酶^[45]。故P450arom与P450Scc的水平将直接影响雌二醇和孕酮的合成。

Lovekamp等^[46]研究了MEHP——DEHP合成的中间代谢产物对雌性大鼠的生殖系统的影响主要是通过降低芳香化酶P450arom——雌激素合成的限速酶的转录活性来抑制雌二醇的合成。刘鹏等^[47]研究表明邻苯二甲酸二丁酯通过抑制青春期雌性大鼠卵巢P450scc基因——孕酮合成的限速酶的表达，降低孕酮的水平。

本实验采用不同剂量的邻苯二甲酸二丁酯对大鼠卵巢颗粒细胞进行染毒，由表1、2可见，邻苯二甲酸二丁酯通过抑制卵巢颗粒细胞中P450arom、P450scc mRNA的表达抑制雌二醇和孕酮的合成及分泌，且抑制作用与邻苯二甲酸二丁酯浓度呈正比。

雌激素具有促使血运增加、子宫发育、肌层变厚等作用；孕激素可以使子宫肌肉松弛、活动能力降低、降低妊娠子宫对催产素的敏感性，有利于孕卵在子宫腔内生长发育。孕激素在雌激素作用下，保证受精卵着床和维持妊娠。雌激素和孕激素相互作用，维持正常生理周期。因此，这两种激素下降必然引起月经失调、流产率增高、胚胎发育障碍。这说明了邻苯二甲酸二丁酯可导致雌性大鼠生殖系统的功能紊乱，对生殖系统具有一定的毒性。

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